步驟二：

標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50ul。

步驟三：

樣本孔中加入待測樣本50ul；空白孔不加。

步驟四：

每孔加入生物素標記抗體50ul，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30分鐘；標準孔空白孔不加。

步驟五：

棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液（350ul），靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

步驟六：

除去空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100ul，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30分鐘。

步驟七：

重復步驟五

步驟八：

每孔加入底物A、B各50ul，37℃避光孵育15分鐘。

步驟九：

每孔加入終止液50ul，15分鐘內在450nm波長(cháng)處測定各孔的OD值。